Metod Validasyonu Nedir? Analitik Metod Doğrulama Rehberi

Bir ilaç firmasının kalite kontrol laboratuvarında çalışıyorsunuz. HPLC ile bir tablet ilacın aktif madde miktarını ölçüyorsunuz. Sonuç yüzde 99,5 çıkıyor. Peki bu sonuca gerçekten güvenebilir misiniz? Metod başka bir analist tarafından yapıldığında aynı sonucu verecek mi? Safsızlıklar ölçümü etkilemiyor mu? Düşük konsantrasyonlarda bile güvenilir sonuç alınabiliyor mu?

İşte metod validasyonu bu soruların tamamını yanıtlayan sistematik bir kanıtlama sürecidir. Analitik bir metodun amaçlanan kullanımı için uygun olduğunun belgelenmiş kanıtlarla ispatlanmasıdır. ICH Q2(R2) kılavuzu, ilaç endüstrisinde analitik metod validasyonunun temel çerçevesini oluşturur.

Ne Zaman Validasyon Gerekir?

Her analitik metod validasyon gerektirmez, ancak belirli durumlar validasyonu zorunlu kılar. Yeni geliştirilen bir analitik metod mutlaka valide edilmelidir. Mevcut bir metodda önemli bir değişiklik yapıldığında revalidasyon gerekir. Metod farklı bir laboratuvara transfer edildiğinde transfer validasyonu yapılır. Alternatif bir metot ile mevcut metot karşılaştırılacaksa karşılaştırmalı validasyon uygulanır.

ICH Q2(R2) kılavuzu, dört metod kategorisi tanımlar. Birinci kategori tanımlama testlerini kapsar. IR spektrumu veya UV spektrumu ile maddenin kimliğinin doğrulanması bu kategoridedir. İkinci kategori safsızlık miktar tayini ve limit testlerini içerir. HPLC ile safsızlık yüzdesi ölçümü veya TLC ile limit testi buna örnektir. Dördüncü kategori ise assay testlerini yani aktif madde miktar tayinini kapsar.

Her kategori için farklı validasyon parametreleri gereklidir. Tanımlama testleri yalnızca özgüllük gerektirir. Safsızlık miktar tayini tüm parametreleri gerektirir. Assay testleri LOD ve LOQ hariç tüm parametreleri gerektirir.

Özgüllük: Doğru Şeyi mi Ölçüyorsunuz?

Özgüllük (specificity), metodun analiti safsızlıklar, matriks bileşenleri ve bozunma ürünleri varlığında bile kesin olarak ölçebilme yeteneğidir.

Bunu kanıtlamak için stres testleri yapılır. Numune asit, baz, oksidatif, termal, fotolitik ve nem koşullarına maruz bırakılır. Oluşan bozunma ürünlerinin ana pikten ayrılıp ayrılmadığı değerlendirilir. Pik saflığı DAD (Diyot Dizisi Dedektörü) veya kütle spektrometresi ile doğrulanır.

Stres testi koşulları genellikle şöyledir: asit için 0,1 ile 1 N HCl 60 ila 80 derece Celsius'ta, baz için 0,1 ile 1 N NaOH aynı sıcaklıkta, oksidatif bozunma için yüzde 3 ile 30 hidrojen peroksit uygulanır.

Doğrusallık ve Aralık: Metod Ne Kadar Geniş Çalışır?

Doğrusallık (linearity), metodun ürettiği yanıtın analit konsantrasyonu ile doğru orantılı olduğu bölgeyi tanımlar. En az beş farklı konsantrasyon seviyesinde, her seviyede üç tekrarlı ölçüm yapılır.

Kabul kriterleri nettir. Korelasyon katsayısı (r) 0,999 ve üzeri olmalıdır. Determinasyon katsayısı (r²) 0,998 ve üzeri beklenir. Y-kesişim noktası istatistiksel olarak değerlendirilir. Artık analiz grafiğinin rastgele bir dağılım göstermesi gerekir.

Aralık (range), metodun uygun doğruluk, kesinlik ve doğrusallık ile sonuç verdiği konsantrasyon bölgesidir. Assay testleri için genellikle yüzde 80 ile 120, içerik homojenliği testleri için yüzde 70 ile 130, çözünme testleri için yüzde 50 ile 120 aralığı değerlendirilir.

Doğruluk: Gerçek Değere Ne Kadar Yakın?

Doğruluk (accuracy), ölçülen değerin gerçek değere yakınlığıdır ve genellikle geri kazanım yüzdesi (percent recovery) olarak ifade edilir.

Değerlendirme için en az üç konsantrasyon seviyesinde, her seviyede üç tekrarlı ölçüm yapılır. Sertifikalı referans malzeme (CRM) kullanımı, bilinen miktarda analit eklenmesi (spike/recovery) veya doğrulanmış bir referans metotla karşılaştırma yöntemleri uygulanabilir.

Assay testleri için kabul edilen geri kazanım aralığı yüzde 98 ile 102'dir. Safsızlık testleri için yüzde 80 ile 120 kabul edilir. Biyoanalitik metodlar için ise yüzde 85 ile 115 aralığı tipiktir.

Kesinlik: Sonuçlar Ne Kadar Tekrarlanabilir?

Kesinlik (precision), aynı homojen numuneye metodun tekrar tekrar uygulanmasında bireysel sonuçların birbirine yakınlığıdır. Üç seviyede değerlendirilir.

Tekrarlanabilirlik (repeatability), aynı analist tarafından aynı ekipmanla kısa süre içinde elde edilen sonuçların uyumudur. En az altı ölçüm veya üç seviyede üçer tekrar yapılır. Assay testleri için yüzde RSD değeri 1,0 ve altında olmalıdır.

Ara kesinlik (intermediate precision), farklı günlerde ve farklı analistlerce elde edilen sonuçların uyumudur. En az iki gün ve iki analist ile değerlendirilir. Assay testleri için yüzde RSD değeri 2,0 ve altında beklenir.

Yeniden üretilebilirlik (reproducibility), farklı laboratuvarlar arasındaki uyumu gösterir ve genellikle metod transferi kapsamında değerlendirilir.

LOD ve LOQ: En Düşük Ne Kadar?

LOD (Limit of Detection) analitik olarak tespit edilebilen en düşük analit miktarıdır. Miktar tayini gerekli değildir; yalnızca varlığın tespiti yeterlidir. Sinyal/gürültü oranı yöntemiyle S/N 3:1 olarak belirlenir veya standart sapma yöntemiyle LOD eşittir 3,3 çarpı sigma bölü eğim formülüyle hesaplanır.

LOQ (Limit of Quantitation) ise kabul edilebilir doğruluk ve kesinlikle miktar tayini yapılabilen en düşük analit miktarıdır. S/N 10:1 olarak belirlenir veya LOQ eşittir 10 çarpı sigma bölü eğim formülüyle hesaplanır.

ICH Q2(R2) önemli bir noktayı vurgular: hesaplama ile bulunan LOQ değeri deneysel olarak doğrulanmalıdır. LOQ seviyesinde yüzde RSD 20 ve altında, geri kazanım yüzde 80 ile 120 arasında olmalıdır.

Dayanıklılık: Metod Ne Kadar Sağlam?

Dayanıklılık (robustness), küçük ama kasıtlı parametre değişikliklerine karşı metodun etkilenmeme kapasitesini ölçer.

HPLC metodları için mobil faz oranı, pH, akış hızı, kolon sıcaklığı, kolon markası ve dalga boyu test edilen parametreler arasındadır. GC metodları için kolon sıcaklığı, akış hızı, enjeksiyon hacmi ve split oranı değerlendirilir.

Deneysel tasarım (DOE) yaklaşımları dayanıklılık çalışmalarında yaygın olarak kullanılır. Plackett-Burman tasarımı faktör taraması için, kesirli faktöriyel tasarım etkileşimlerin değerlendirilmesi için tercih edilir.

ICH Q2(R2): Yeni Yaklaşım

2023 yılında yayımlanan ICH Q2(R2), önceki versiyona göre önemli değişiklikler içerir. En temel fark, "kontrol listesi" yaklaşımından yaşam döngüsü bazlı bir modele geçiştir.

Q2(R2) analitik metodun yaşamını üç aşamaya ayırır: metod geliştirme, metod validasyonu ve sürekli metod performans doğrulaması. Bu yaklaşım, validasyonun tek seferlik bir faaliyet değil, sürekli bir süreç olduğunu vurgular.

Çok değişkenli analitik prosedürler ve ileri teknolojiler için de rehberlik eklenmiştir. ICH Q14 (Analytical Procedure Development) ile birlikte Q2(R2), analitik yaşam döngüsü yönetiminin bütünleşik çerçevesini oluşturur.

Kaynaklar

• ICH – Q2(R2) Validation of Analytical Procedures Guideline (database.ich.org)
• EMA – ICH Q2(R2) Scientific Guideline (ema.europa.eu)
• IntuitionLabs – ICH Q2(R2) Analytical Method Validation Guide (intuitionlabs.ai)
• Lab Manager – ICH and FDA Guidelines for Analytical Method Validation (labmanager.com)
• AMSbiopharma – ICH Guidelines Explained (amsbiopharma.com)