Farmasötik Mikrobiyoloji Testleri
Farmasötik mikrobiyoloji, ilaç ürünlerinin, ham maddelerin ve üretim ortamlarının mikrobiyolojik kalitesini değerlendiren kritik bir disiplindir. Sterilite testi, bakteriyel endotoksin testi (LAL), bioburden ve çevresel izleme (EM), GMP uyumlu üretimin temel kontrol noktalarıdır.
Neden kritik? Kontamine ilaç ürünleri hasta güvenliğini tehlikeye atar. Özellikle parenteral ürünlerde mikrobiyolojik kontaminasyon ölümcül olabilir.
1. Sterilite Testi
Sterilite Testi Nedir?
Sterilite testi, steril olması gereken farmasötik ürünlerin canlı mikroorganizma içerip içermediğini belirleyen testtir.
Uygulama alanları:
- Parenteral ürünler (enjeksiyonluk)
- Oftalmik preparatlar
- Steril toz ve liyofilize ürünler
- İmplantlar ve cerrahi malzemeler
- Steril ham maddeler
Farmakope Gereksinimleri
USP <71> ve Ph. Eur. 2.6.1:
| Parametre | Gereksinim |
|---|---|
| Test ortamı | Aseptik koşullar (izolator veya LAF) |
| Besiyerleri | FTM (aerobik/anaerobik) + TSB (aerobik/mantar) |
| İnkübasyon | FTM: 30-35°C, TSB: 20-25°C |
| Süre | Minimum 14 gün |
| Numune sayısı | Batch büyüklüğüne göre |
Test Yöntemleri
1. Membran Filtrasyon Yöntemi:
- Sıvı ürünler için tercih edilir
- 0.45 μm membran filtre
- Antimikrobiyal aktivite nötralizasyonu
- Filtre, besiyerine transfer edilir
2. Direkt İnokulasyon:
- Filtrasyon uygun olmayan ürünler
- Yağlı, visköz preparatlar
- Numune doğrudan besiyerine eklenir
Metot Uygunluk Testi (Suitability)
Sterilite testinden önce metodun uygunluğu doğrulanmalıdır:
Test organizmaları:
- Staphylococcus aureus (ATCC 6538)
- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)
- Bacillus subtilis (ATCC 6633)
- Candida albicans (ATCC 10231)
- Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404)
- Clostridium sporogenes (ATCC 19404) - anaerobik
Kabul kriteri: Pozitif kontroller üreme göstermeli, ürün inhibisyon yapmamalı.
Sterilite Test Başarısızlığı
Başarısız sonuç durumunda:
- Laboratuvar hatası değerlendirmesi
- Üretim kayıtları incelemesi
- Çevresel izleme verileri kontrolü
- Aseptik proses değerlendirmesi
- Gerekirse yeniden test (şüpheli sonuç için)
Dikkat: Sterilite testi başarısızlığı ciddi bir kalite olayıdır ve kapsamlı soruşturma gerektirir.
2. Bakteriyel Endotoksin Testi (LAL/BET)
Endotoksin Nedir?
Bakteriyel endotoksinler, gram-negatif bakterilerin hücre duvarındaki lipopolisakkaritlerdir (LPS). Parenteral ürünlerde endotoksin varlığı ateş (pirojenisite) ve septik şoka neden olabilir.
LAL Testi Prensibi
LAL (Limulus Amebocyte Lysate), at nalı yengecinin (Limulus polyphemus) kan hücrelerinden elde edilen lizattır. Endotoksin varlığında enzimatik bir kaskad aktive olur.
Reaksiyon mekanizması:
Endotoksin → Faktör C aktivasyonu → Faktör B aktivasyonu →
Pıhtılaşma enzimi → Koagulojen → Koagulin (jel oluşumu)
LAL Test Yöntemleri
1. Jel Pıhtılaşma Yöntemi:
- Limit testi (geçti/kaldı)
- Semi-kantitatif
- Basit ve ekonomik
- Görsel değerlendirme
2. Türbidimetrik Yöntem:
- Kantitatif
- Kinetik ölçüm
- Bulanıklık artışı izlenir
- Otomatize sistemler
3. Kromojenik Yöntem:
- Kantitatif
- Renk değişimi ölçümü
- Kinetik veya uç nokta
- En hassas yöntem
4. Rekombinant Faktör C (rFC):
- Hayvan kaynaklı olmayan alternatif
- At nalı yengeci kullanılmaz
- Floresan veya kromojenik dedeksiyon
Farmakope Limitleri
USP <85> ve Ph. Eur. 2.6.14:
| Ürün Türü | Endotoksin Limiti |
|---|---|
| Parenteral (genel) | 5 EU/kg/saat |
| İntratekal ürünler | 0.2 EU/kg |
| Radyofarmasötikler | 175 EU/V (maksimum) |
| Steril su (enjeksiyonluk) | 0.25 EU/mL |
| Steril su (irrigasyon) | 0.5 EU/mL |
EU: Endotoksin Unit (Endotoksin Birimi)
İnterfering Faktörler
Inhibisyon nedenleri:
- Kelatlayıcı ajanlar (EDTA, sitrat)
- Yüzey aktif maddeler
- Protein içeriği
- Ekstrem pH
- Antimikrobiyal maddeler
Çözümler:
- Uygun seyreltme
- Özel tamponlar
- Validasyon (spike recovery)
3. Bioburden (Biyoyük) Testi
Bioburden Nedir?
Bioburden, bir ürün veya malzeme üzerindeki canlı mikroorganizma sayısını ifade eder. Sterilizasyon öncesi mikrobiyal yük belirlenir.
Test Yöntemi
USP <61> ve Ph. Eur. 2.6.12:
Toplam Aerobik Mikrobiyal Sayım (TAMC):
- TSA besiyeri
- 30-35°C inkübasyon
- 3-5 gün
Toplam Kombine Maya/Küf Sayımı (TYMC):
- SDA besiyeri
- 20-25°C inkübasyon
- 5-7 gün
Numune Hazırlama
Yöntemler:
- Membran filtrasyon (sıvılar)
- Pour plate (seyreltmeler)
- Spread plate (yüzey ekimi)
- MPN (en muhtemel sayı)
Nötralizasyon: Antimikrobiyal aktivite gösteren ürünlerde uygun nötralizan kullanılmalı.
Farmakope Limitleri
Non-steril ürünler için (USP <1111>):
| Ürün Kategorisi | TAMC | TYMC |
|---|---|---|
| Oral sıvılar (sulu) | 10² CFU/mL | 10¹ CFU/mL |
| Oral sıvılar (sulu olmayan) | 10³ CFU/mL | 10² CFU/mL |
| Oral katılar | 10³ CFU/g | 10² CFU/g |
| Rektal | 10³ CFU/g | 10² CFU/g |
| Topikal (sulu) | 10² CFU/g | 10¹ CFU/g |
Belirli Patojenlerin Yokluğu
USP <62> ve Ph. Eur. 2.6.13:
| Organizma | Aranılan Ürün Türü |
|---|---|
| E. coli | Oral ürünler |
| Salmonella | Oral ürünler |
| P. aeruginosa | Topikal, solunum, kulak |
| S. aureus | Topikal, nazal |
| C. albicans | Vajinal ürünler |
| Clostridia | Rektal ürünler |
| Safra-tolerant gram negatifler | Oral ürünler |
4. Çevresel İzleme (Environmental Monitoring)
EM Nedir?
Çevresel izleme, temiz oda ve kontrollü ortamların mikrobiyal ve partikül kontaminasyon açısından sistematik olarak izlenmesidir.
İzleme Parametreleri
1. Havadaki Partikül İzleme:
- Non-viable partikül sayımı
- ≥0.5 μm ve ≥5.0 μm partiküller
- Sürekli veya periyodik izleme
2. Havadaki Mikrobiyal İzleme:
- Aktif hava örnekleme (impactor/impinger)
- Pasif hava örnekleme (settle plate)
- CFU/m³ veya CFU/4 saat
3. Yüzey İzleme:
- Kontak plakları (RODAC)
- Swap örnekleme
- CFU/25 cm² veya CFU/swap
4. Personel İzleme:
- Eldiven parmak ucu baskısı
- Giysi örneklemesi
GMP Sınıflandırması
EU GMP Annex 1 (2022 revizyonu):
| Sınıf | At Rest (Partikül/m³) | In Operation (Partikül/m³) |
|---|---|---|
| ≥0.5μm / ≥5.0μm | ≥0.5μm / ≥5.0μm | |
| A | 3,520 / 20 | 3,520 / 20 |
| B | 3,520 / 29 | 352,000 / 2,900 |
| C | 352,000 / 2,900 | 3,520,000 / 29,000 |
| D | 3,520,000 / 29,000 | Tanımlanmamış |
Mikrobiyal Limitler (Aksiyon Limitleri)
EU GMP Annex 1:
| Sınıf | Hava (CFU/m³) | Settle Plate (CFU/4h) | Kontak (CFU/25cm²) | Eldiven (CFU/eldiven) |
|---|---|---|---|---|
| A | <1 | <1 | <1 | <1 |
| B | 10 | 5 | 5 | 5 |
| C | 100 | 50 | 25 | - |
| D | 200 | 100 | 50 | - |
EM Programı Oluşturma
Risk bazlı yaklaşım:
- Kritik alanların belirlenmesi
- Örnekleme noktalarının seçimi
- Örnekleme frekansının belirlenmesi
- Alert ve aksiyon limitlerinin tanımı
- Trend analizi
Örnekleme noktası seçimi:
- Aseptik işlem noktaları
- Personel yakın çalışma alanları
- Hava akış değişim noktaları
- Tarihsel problem alanları
Size Uygun Eğitimi Bulun
Bireysel mi yoksa kurumsal mı eğitim arıyorsunuz?
Metot Validasyonu
Validasyon Parametreleri
Mikrobiyolojik metotlar için:
- Metot uygunluğu (suitability)
- Özgüllük/seçicilik
- Tespit limiti (LOD)
- Doğruluk (recovery)
- Tekrarlanabilirlik
- Ara kesinlik
- Sağlamlık (robustness)
Growth Promotion Testi
Besiyerlerinin performans kontrolü:
- Pozitif kontrol organizmaları
- Negatif kontrol (sterilite)
- Her besiyeri lotunda
- Kabul kriteri: Uygun üreme
OOS ve OOT Yönetimi
Mikrobiyolojik OOS
Spesifikasyon dışı sonuç (OOS) araştırması:
Faz 1 - Laboratuvar araştırması:
- Hesaplama kontrolü
- Besiyeri ve reaktif kontrolü
- Ekipman durumu
- Analitik teknik değerlendirmesi
Faz 2 - Genişletilmiş araştırma:
- Numune incelemesi
- Üretim kayıtları
- Çevresel veriler
- Kök neden analizi
Trend Analizi (OOT)
Trend dışı (OOT) değerlendirmesi:
- Kontrol kartları
- Alert limit yaklaşımları
- İstatistiksel trend analizi
- Önleyici aksiyonlar
İlgili Kariyer Pozisyonları
1. Mikrobiyoloji Uzmanı (Farmasötik)
Görevler:
- Sterilite, LAL, bioburden testleri
- Çevresel izleme programı
- Metot validasyonu
- OOS araştırmaları
Aranan yetkinlikler:
- Mikrobiyoloji/biyoloji derecesi
- GMP bilgisi
- Farmakope bilgisi (USP, Ph.Eur)
- Aseptik teknik deneyimi
2. QC Mikrobiyoloji Laboratuvar Yöneticisi
Görevler:
- Laboratuvar operasyonlarının yönetimi
- Personel eğitimi ve yetkilendirme
- Metot transferi ve validasyon
- Denetim hazırlığı
Aranan yetkinlikler:
- İleri derece tercih (MSc)
- Kapsamlı QC deneyimi
- Liderlik becerileri
- Düzenleyici bilgi
![ELISA Nedir? Çalışma Prensibi ve Uygulama Alanları [{YEAR}]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fimages.unsplash.com%2Fphoto-1434030216411-0b793f4b4173%3Fw%3D800%26q%3D80&w=3840&q=75)
![FPLC Nedir? Protein Saflaştırma Kromatografisi [{YEAR}]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fimages.unsplash.com%2Fphoto-1454165804606-c3d57bc86b40%3Fw%3D800%26q%3D80&w=3840&q=75)
![SDS-PAGE Nedir? Protein Elektroforezi Rehberi [{YEAR}]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fimages.unsplash.com%2Fphoto-1516321318423-f06f85e504b3%3Fw%3D800%26q%3D80&w=3840&q=75)
