ELISA Nedir?

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), antijen veya antikorların enzim işaretli problar kullanılarak tespit edildiği ve ölçüldüğü immünolojik analiz yöntemidir. 1971'de Engvall ve Perlmann tarafından geliştirilmiş olup, günümüzde klinik tanı, gıda güvenliği ve araştırma laboratuvarlarının vazgeçilmez tekniklerinden biridir.

Temel Prensip: Antijen-antikor etkileşiminin yüksek özgüllüğü + Enzim reaksiyonunun yüksek hassasiyeti

---

ELISA Nasıl Çalışır?

Temel Adımlar

1. Kaplama (Coating): Antijen veya antikor mikroplaka kuyucuklarına bağlanır
2. Bloklama: Boş bağlanma bölgeleri bloke edilir (BSA, süt proteini)
3. Numune İlavesi: Test edilecek numune eklenir
4. Yıkama: Bağlanmamış maddeler uzaklaştırılır
5. Konjugat İlavesi: Enzim işaretli antikor eklenir
6. Substrat İlavesi: Enzim substratı eklenir
7. Renk Gelişimi: Enzimatik reaksiyon sonucu renk oluşur
8. Okuma: Spektrofotometrik ölçüm (absorbans)

Kullanılan Enzimler

Enzim	Substrat	Renk	Dalga Boyu
HRP (Horseradish Peroxidase)	TMB	Mavi → Sarı	450 nm
AP (Alkaline Phosphatase)	pNPP	Sarı	405 nm

HRP en yaygın kullanılan enzimdir; yüksek turnover hızı ve stabil konjugatlar sağlar.

---

ELISA Türleri

1. Direkt ELISA

Antijen → Enzim-işaretli Antikor → Substrat → Renk

Avantajlar:

• Basit protokol
• Hızlı sonuç

Dezavantajlar:

• Düşük sinyal amplifikasyonu
• Her antijen için işaretli antikor gerekli

Kullanım: Antijen tarama, hızlı testler

---

2. İndirekt ELISA

Antijen → Primer Antikor → Enzim-işaretli Sekonder Antikor → Substrat

Avantajlar:

• Sinyal amplifikasyonu
• Tek sekonder antikor birçok primer için kullanılabilir
• Maliyet etkin

Dezavantajlar:

• Daha fazla adım
• Çapraz reaktivite riski

Kullanım: Antikor tespiti (HIV, Hepatit tarama)

---

3. Sandwich ELISA

Yakalama Antikoru → Antijen → Deteksiyon Antikoru (enzim-işaretli) → Substrat

Avantajlar:

• Yüksek özgüllük (iki antikor)
• Yüksek hassasiyet
• Kompleks numunelerde çalışır

Dezavantajlar:

• Matched antibody pair gerekli
• Küçük antijenler için uygun değil

Kullanım: Sitokin ölçümü, hormon tespiti, biyomarker analizi

---

4. Kompetitif ELISA

Numune antijeni + İşaretli antijen → Antikor için yarışma

Avantajlar:

• Küçük moleküller için uygun
• Geniş dinamik aralık

Dezavantajlar:

• Ters orantılı sonuç (yüksek konsantrasyon = düşük sinyal)
• Optimizasyon zor

Kullanım: İlaç seviyeleri, hormonlar, haptanlar

---

ELISA Protokol Optimizasyonu

Kritik Parametreler

Parametre	Optimize Edilecek	Tipik Aralık
Kaplama konsantrasyonu	Antijen/Antikor	1-10 µg/mL
Kaplama süresi	İnkübasyon	4°C gece veya 37°C 2 saat
Bloklama	Tampon, süre	%1-5 BSA, 1-2 saat
Numune dilüsyonu	Doğrusal aralık	Matrise bağlı
Konjugat dilüsyonu	S/N oranı	Titrasyon ile
Substrat süresi	Sinyal/arka plan	15-30 dakika

Yıkama Protokolü

• Tampon: PBS-Tween (%0.05-0.1)
• Tekrar: 3-5 kez
• Hacim: 300 µL/kuyucuk minimum
• Önem: Yetersiz yıkama = yüksek arka plan

---

Kalite Kontrol

Plaka İçi Kontroller

Kontrol	Amaç	Beklenen Sonuç
Pozitif Kontrol	Testin çalıştığı	Yüksek sinyal
Negatif Kontrol	Spesifiklik	Düşük sinyal
Blank	Arka plan	Minimal sinyal
Kalibratörler	Standart eğri	Doğrusal

Performans Kriterleri

• CV (Coefficient of Variation): Intra-assay <10%, Inter-assay <15%
• Doğrusallık: R² > 0.99
• Geri kazanım: %80-120
• LOD (Detection Limit): pg/mL-ng/mL aralığında

---

Uygulama Alanları

Klinik Tanı

• Enfeksiyon hastalıkları: HIV, HBV, HCV, COVID-19 antikor testleri
• Otoimmün hastalıklar: ANA, anti-dsDNA, RF
• Hormon ölçümü: TSH, T3, T4, kortizol, insulin
• Tümör markerleri: PSA, CA-125, AFP
• Alerji testleri: Spesifik IgE

İlaç Geliştirme

• Farmakokinetik: İlaç seviyeleri, metabolitler
• İmmünojenislik: Anti-drug antibody (ADA)
• Biyobenzerlik: PK karşılaştırma

Gıda Güvenliği

• Allerjen tespiti: Gluten, fıstık, süt proteini
• Mikotoksin: Aflatoksin, okratoksin
• Antibiyotik kalıntısı: Süt, et örnekleri
• GMO tespiti: Transgenik protein analizi

Araştırma

• Sitokin profilleme: IL-6, TNF-α, IFN-γ
• Büyüme faktörleri: VEGF, EGF
• Nörobilim: Nörotransmitter ölçümü

---

ELISA vs Diğer İmmünoassayler

Özellik	ELISA	Western Blot	RIA	Lateral Flow
Hassasiyet	pg-ng/mL	ng/mL	pg/mL	ng/mL
Throughput	Yüksek (96-384)	Düşük	Orta	Çok yüksek
Kantitatif	Evet	Yarı-kantitatif	Evet	Kalitatif
Süre	4-24 saat	1-2 gün	Saatler	15-30 dk
Ekipman	Plaka okuyucu	Blotting sistemi	Gama sayıcı	Yok

---

Troubleshooting

Yüksek Arka Plan

• Yetersiz yıkama → Yıkama tekrarını artır
• Aşırı konjugat → Dilüsyonu artır
• Yetersiz bloklama → Bloklama süresini uzat
• Kontamine solüsyonlar → Taze hazırla

Düşük Sinyal

• Reaktif degradasyonu → Son kullanma kontrolü
• Yetersiz inkübasyon → Süreyi uzat
• Yanlış dilüsyon → Protokolü kontrol et
• Plaka tipi uyumsuzluğu → High-binding plaka kullan

Yüksek CV

• Pipetleme hatası → Kalibrasyon, teknik
• Kenar etkisi → Kenar kuyucuklarını kullanma
• Homojen olmayan yıkama → Otomatik yıkayıcı kullan
• Sıcaklık varyasyonu → Kontrollü ortam

---

Laboratuvar Gereksinimleri

Ekipman

• Mikroplaka okuyucu (absorbans)
• Mikroplaka yıkayıcı
• İnkübatör (37°C)
• Multichannel pipetler
• Vorteks, santrifüj

Sarf Malzemeler

• 96-well mikroplakalar (high-binding)
• ELISA kitleri veya antikor/konjugat
• Tamponlar (kaplama, yıkama, dilüsyon)
• Substratlar (TMB, pNPP)
• Stop solüsyonu (H₂SO₄, NaOH)

---

---

İlgili Konular

• Seroloji Testleri Nelerdir?
• PCR Nedir?
• Validasyon Nedir?
• Tampon Nedir?