FPLC Nedir?

FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography), proteinlerin biyolojik aktivitelerini koruyarak hızlı ve verimli şekilde saflaştırılmasını sağlayan sıvı kromatografi tekniğidir. 1982'de Pharmacia (şimdi Cytiva) tarafından geliştirilmiş olup, biyoteknoloji ve ilaç sektörünün temel protein saflaştırma yöntemidir.

FPLC vs HPLC:

FPLC: Düşük basınç (0.1-5 MPa), biyomoleküller, aktivite korunur
HPLC: Yüksek basınç (10-40 MPa), küçük moleküller, denatürasyon riski

FPLC Nasıl Çalışır?

Sistem Bileşenleri

Tampon → Pompa → Enjektör → Kolon → Dedektör → Fraksiyon Toplayıcı
   A,B                                UV/Cond        ↓
    ↓                                              Fraksiyonlar
 Gradient
  Mixer

Bileşen	Fonksiyon
Pompa	Düşük basınçta hassas akış kontrolü
Gradient mixer	İki tamponun karıştırılması
Enjektör/Sample loop	Numune yükleme
Kolon	Kromatografik ayırma
UV dedektör	280 nm'de protein absorbansı
Kondüktivite dedektör	Tuz gradyenti izleme
Fraksiyon toplayıcı	Otomatik fraksiyon toplama

Yaygın FPLC Sistemleri

Marka	Model	Kapasite
Cytiva	ÄKTA pure	Lab-scale
Cytiva	ÄKTA avant	Process development
Cytiva	ÄKTA pilot	Pilot-scale
Bio-Rad	NGC	Lab-scale
Thermo	DIONEX	Multi-purpose

Protein Saflaştırma Teknikleri

1. İyon Değişim Kromatografisi (IEX)

Proteinler net yüklerine göre ayrılır.

Anyon değişim (AEX):

Kolon: Q Sepharose, DEAE
Bağlanan: Negatif yüklü proteinler (pI < pH)
Elüsyon: Artan NaCl gradyenti

Katyon değişim (CEX):

Kolon: SP Sepharose, CM
Bağlanan: Pozitif yüklü proteinler (pI > pH)
Elüsyon: Artan NaCl gradyenti

Kolon Tipi	Fonksiyonel Grup	Güç	Kullanım
Q	Kuaterner amin	Güçlü anyon	Geniş pH aralığı
DEAE	Dietilaminoetil	Zayıf anyon	Hassas proteinler
SP	Sülfonil propil	Güçlü katyon	Geniş pH aralığı
CM	Karboksimetil	Zayıf katyon	Hassas proteinler

2. Afinite Kromatografisi (AC)

Proteinler spesifik ligand etkileşimine göre ayrılır. En yüksek saflık sağlayan tekniktir.

Ligand	Hedef Protein	Uygulama
Protein A/G	IgG antikorları	Antikor saflaştırma
Ni-NTA	His-tag proteinler	Rekombinant protein
Glutathione	GST-tag proteinler	Füzyon proteinler
Heparin	DNA-bağlayan proteinler	Büyüme faktörleri
Streptavidin	Biotin-işaretli	Çeşitli

IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography):

His-tag protein + Ni²⁺-NTA → Bağlanma → İmidazol ile elüsyon

Elüsyon gradyenti: 20 mM → 500 mM imidazol

3. Jel Filtrasyon (SEC)

Proteinler boyutlarına göre ayrılır. İzokratik elüsyon (gradient yok).

Prensip: Büyük moleküller gözeneklere giremez, hızlı elüe olur. Küçük moleküller gözeneklere girer, yavaş elüe olur.

Kolon	MW Aralığı	Uygulama
Superdex 75	3-70 kDa	Küçük proteinler
Superdex 200	10-600 kDa	Orta proteinler
Superose 6	5-5000 kDa	Büyük kompleksler

SEC Uygulamaları:

Tampon değişimi (desalting)
Oligomerizasyon durumu analizi
MW tayini
Agregat kontrolü

4. Hidrofobik Etkileşim (HIC)

Proteinler yüzey hidrofobisitesine göre ayrılır.

Prensip: Yüksek tuz konsantrasyonunda hidrofobik etkileşim artar, düşük tuzda azalır.

Kolon türleri: Phenyl, Butyl, Octyl Sepharose

Gradient: Yüksek → Düşük amonyum sülfat

FPLC Metot Geliştirme

Strateji Seçimi

Ham Ekstrakt
     │
     ▼
Yakalama (Capture) ─── Afinite veya IEX
     │                   Yüksek kapasite
     ▼
Ara Saflaştırma ────── IEX veya HIC
     │                   Safsızlık uzaklaştırma
     ▼
Parlatma (Polishing) ── SEC
     │                   Agregat, tampon değişimi
     ▼
Saf Protein

Kolon Seçim Kriterleri

Kriter	Değerlendirme
Hedef protein pI	IEX tipi seçimi
Tag varlığı	Afinite seçimi
MW	SEC seçimi
Stabilite	pH, tuz toleransı
Safsızlıklar	Çoklu adım planı

FPLC Protokol Örneği

His-tag Protein Saflaştırma (Ni-NTA)

Tamponlar:

A: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol
B: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol

Protokol:

Adım	Hacim (CV)	%B	Akış	Amaç
Equilibration	5	0	1 mL/min	Kolon hazırlama
Sample load	-	0	0.5 mL/min	Protein bağlama
Wash	10	0	1 mL/min	Safsızlık uzaklaştırma
Elution	10	0→100	1 mL/min	Protein elüsyonu
Strip	5	100	1 mL/min	Kolon temizleme
Re-equilibration	5	0	1 mL/min	Sonraki çalışma

CV: Column Volume (kolon hacmi)

Kalite Kontrol

Saflaştırma Sonrası Analizler

Analiz	Yöntem	Amaç
Saflık	SDS-PAGE, HPLC	% saflık belirleme
Konsantrasyon	A280, BCA	Verim hesaplama
Aktivite	Enzim assay	Fonksiyon kontrolü
Agregasyon	SEC, DLS	Stabilite
Endotoksin	LAL testi	Biyolojik güvenlik

Kolon Performans Takibi

HETP (Height Equivalent to Theoretical Plate): Kolon verimliliği
Asimetri faktörü: Pik şekli (1.0 ideal)
Basınç takibi: Kolon tıkanıklığı göstergesi
Geri kazanım: Kütle dengesi kontrolü

Size Uygun Eğitimi Bulun

Bireysel mi yoksa kurumsal mı eğitim arıyorsunuz?

Troubleshooting

Düşük Bağlama Kapasitesi

Yanlış pH (pI kontrolü)
Yetersiz equilibration
Kolon eskimesi
Kompetitif bağlanma (imidazol, tuz)

Zayıf Ayrım

Yetersiz gradient uzunluğu
Yanlış kolon seçimi
Aşırı yükleme
Tampon uyumsuzluğu

Protein Kaybı

Non-spesifik bağlanma
Proteaz degradasyonu (inhibitör ekle)
Agregasyon (DTT, gliserol ekle)
Yanlış elüsyon koşulları

FPLC vs Diğer Yöntemler

Özellik	FPLC	HPLC	Batch
Basınç	Düşük	Yüksek	Yok
Rezolüsyon	Yüksek	Çok yüksek	Düşük
Otomasyon	Tam	Tam	Manuel
Aktivite koruma	İyi	Risk var	İyi
Ölçeklenebilirlik	Kolay	Zor	Kolay
Maliyet	Orta	Yüksek	Düşük

Ölçeklendirme

Ölçek	Kolon Çapı	Hacim	Uygulama
Analitik	4.6-7.8 mm	1-5 mL	Metot geliştirme
Preparatif	16-26 mm	20-100 mL	Lab-scale
Pilot	50-100 mm	0.5-5 L	Process development
Üretim	200+ mm	10-1000 L	Manufacturing

Ölçeklendirme kuralı: Kolon yüksekliği sabit, çap arttırılır. Linear velocity korunur.

DSP Uzmanı ve FPLC

Downstream Processing (DSP) Uzmanı, biyoteknoloji üretiminde hücre hasadından final ürüne kadar tüm saflaştırma süreçlerini yönetir. FPLC, DSP uzmanının temel yetkinliklerinden biridir.

DSP Uzmanı Görevleri: