LC-MS Nedir? Sivi Kromatografi Kutle Spektrometresi Rehberi
Bir karisimin icindeki bilesenleri hem ayirmak hem de tanimlamak istiyorsaniz, LC-MS tam da bu is icin tasarlanmis bir teknik. Sivi kromatografisinin ayirma gucu ile kutle spektrometresinin tanimlama yetenegini tek bir sistemde birlestiren LC-MS, modern analitik kimyanin en guclu araclarindan biri haline geldi.
Ilac gelistirmeden gida guvenligine, cevre analizinden klinik teshise kadar pek cok alanda LC-MS artik vazgecilmez. Bu rehberde, LC-MS'in calisma prensibini, bilesen yapisini, iyonizasyon tekniklerini ve uygulama alanlarini detayli sekilde inceleyecegiz.
LC-MS Temel Calisma Prensibi
LC-MS, iki temel teknigin birlesiminden olusur:
LC (Liquid Chromatography): Sivi kromatografisi, karisim icindeki bilesenleri fiziksel ve kimyasal ozelliklerine gore ayirir. Numune, bir mobil faz (cozucu) esliginde kolon icindeki sabit fazdan gecirilir. Her bilesen, sabit fazla farkli gucte etkilesime girdigi icin kolondan farkli zamanlarda cikar.
MS (Mass Spectrometry): Kutle spektrometresi, kolondan cikan bilesenleri iyonize eder ve bu iyonlari kutle/yuk (m/z) oranlarina gore ayirir. Her bilesenin benzersiz bir kutle spektrumu olusur ve bu spektrum bilesen tanimlama icin kullanilir.
Surecin akisi soyledir:
- Numune hazirlama ve enjeksiyon
- LC kolonunda kromatografik ayirma
- Kolondan cikan eluatin iyonizasyon kaynagina aktarimi
- Iyonizasyon (sivi fazdan gaz fazina gecis ve iyon olusumu)
- Kutle analizorunde m/z oranina gore ayirma
- Detektor ile iyon sayimi
- Veri isleme ve spektrum analizi
LC-MS'in en kritik noktasi, sivi fazdan gaz fazina gecis asamasidir. GC-MS sistemlerinde numune zaten gaz fazindadir, ancak LC-MS'te sivi mobil fazin uzaklastirilmasi ve analitlerin iyonize edilmesi gerekir. Bu sorunu cozen iyonizasyon teknikleri, LC-MS'in gelisiminde devrim yaratmistir.
LC-MS ile GC-MS Karsilastirmasi: Hangisi Ne Zaman Kullanilir?
Bu soru, analitik laboratuvarlarda en sik sorulan sorulardan biridir. Her iki teknigin guclu oldugu alanlar farklidir.
| Ozellik | LC-MS | GC-MS |
|---|---|---|
| Mobil faz | Sivi (su, asetonitril, metanol) | Gaz (helyum, hidrojen) |
| Uygun numune tipi | Polar, non-ucucu, termolabil bilesenler | Ucucu, termal stabil bilesenler |
| Molekul agirligi | Kucuk molekullerden buyuk proteinlere kadar | Genellikle < 1000 Da |
| Turevlendirme | Genellikle gerekmez | Siklikla gerekir (non-ucucu maddeler icin) |
| Iyonizasyon | ESI, APCI, APPI | EI, CI |
| Tipik uygulamalar | Ilac metabolitleri, peptidler, gida katki maddeleri | Pestisitler, ucucu organikler, petrokimyasallar |
| Hassasiyet | ppb - ppt | ppb - ppt |
Genel kural: Bilesen suda cozunuyorsa veya isiya duyarliysa LC-MS; ucucuysa ve termal stabilse GC-MS tercih edilir. Bazi laboratuvarlar her iki sistemi de bulundurur cunku bazi analizlerde biri digerinin yerine gecemez.
Iyonizasyon Teknikleri
LC-MS'in kalbi, sivi fazdaki analitleri gaz fazinda iyonlara donusturebilen iyonizasyon kaynagindadir. Uc temel teknik kullanilir.
ESI (Electrospray Ionization - Elektropuskurtme Iyonizasyon)
ESI, LC-MS'te en yaygin kullanilan iyonizasyon teknigidir. Calismasi su sekildedir:
- LC'den gelen eluat, ince bir kapiler ucundan puskurtulur
- Kapilere yuksek voltaj (2-5 kV) uygulanir
- Yuksek voltaj etkisiyle sivi, kucuk yuklu damlaciklara ayrisir
- Cozucu buharlasmaya devam ettikce damlaciklar kuculur
- Sonunda tek tek yuklu iyonlar olusur
ESI'nin ozellikleri:
- Yumusak iyonizasyon: Molekul butunlugunu korur, fragmentasyon dusuktur
- Coklu yukleme: Buyuk molekuller birden fazla yuk tasiyabilir (proteinler, peptidler icin ideal)
- Hem pozitif hem negatif mod calismasi mumkun
- Polar ve orta-polar bilesenler icin uygundur
- Akis hizi: tipik olarak 0,1 - 1 mL/dk
ESI, ilac molekulleri, peptidler, proteinler, nukleotidler ve metabolitler icin birinci tercih iyonizasyon yontemidir.
APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
APCI, ESI'nin yetersiz kaldigi daha az polar bilesenler icin kullanilir.
- LC eluati bir nebulizer ile puskurtulur
- Isitilmis bir tup icinden gecirilir (400-500 derece C) ve buharlasmasi saglanir
- Bir korona desarj ignesi ile gaz fazindaki cozucu molekulleri iyonize edilir
- Iyonize cozucu molekulleri, analit molekullerine yuk transfer eder (kimyasal iyonizasyon)
APCI'nin ozellikleri:
- ESI'ye gore daha az polar bilesenler icin uygundur
- Tek yuklu iyonlar uretir (daha basit spektrumlar)
- Termal stabil bilesenler gerektirir (yuksek sicaklik kullanilir)
- Steroidler, lipidler, vitaminler ve bazi ilac molekulleri icin tercih edilir
APPI (Atmospheric Pressure Photoionization)
APPI, en az polar bilesenlerin iyonizasyonu icin kullanilir.
- APCI'ye benzer buharlasmam sistemi
- Korona desarj yerine UV lamba (genellikle kripton lambasi, 10 eV) kullanilir
- Fotonlar dogrudan analitleri iyonize eder veya bir dopant (toluen, aseton) uzerinden dolayliya iyonizasyon saglar
APPI'nin ozellikleri:
- Apolara bilesenlere uygun (PAH'lar, bazi steroidler)
- Dusuk kimyasal gurultu
- APCI ve ESI ile iyonize edilemeyen bilesenler icin son cozum
Iyonizasyon Tekniigi Secim Rehberi
| Bilesen Tipi | Polarite | Onerilen Teknik |
|---|---|---|
| Peptidler, proteinler | Yuksek polar | ESI |
| Ilac molekulleri, metabolitler | Orta polar | ESI |
| Steroidler, lipidler | Dusuk-orta polar | APCI |
| Vitaminler | Degisken | ESI veya APCI |
| PAH'lar, apolar bilesenler | Apolar | APPI |
| Sekerler, amino asitler | Yuksek polar | ESI |
Kutle Analizorleri
Iyonize edilen molekuller, kutle analizorunde m/z oranlarina gore ayrilir. Farkli analizor turleri, farkli performans ozellikleri sunar.
Quadrupole (Dort Kutuplu)
En yaygin kutle analizoru. Dort paralel metal cubuktan olusur. Bu cubuklara uygulanan RF (radyo frekans) ve DC (dogru akim) voltajlari, belirli m/z oranindaki iyonlarin gecisine izin verirken digerlerini filtreler.
- Avantaj: Kompakt, guvenilir, ekonomik, kolay kullanim
- Dezavantaj: Dusuk cozunurluk, sinirli kutle araligi
- Kullanim: Rutin kantitatif analiz, kalite kontrol
TOF (Time-of-Flight - Ucus Zamani)
Iyonlar ayni kinetik enerji ile hizlandirilir ve bir ucus tupunden gecirilir. Hafif iyonlar agir iyonlardan once detektore ulasir. Kutle, ucus suresinden hesaplanir.
- Avantaj: Yuksek cozunurluk, yuksek kutle dogrulugu, hizli tarama
- Dezavantaj: Quadrupole'e gore daha pahali
- Kullanim: Bilinmeyen bilesen tanimlama, metabolomik, formulasyon dogrulama
Ion Trap (Iyon Tuzagi)
Iyonlar, bir elektrik alani icinde tutulur ve ardindan secici olarak salivelir. MS/MS ve hatta MS^n deneyleri tek bir analizor icinde yapilabilir.
- Avantaj: MSn kabiliyeti (yapisal aydinlatma), kompakt
- Dezavantaj: Sinirli dinamik aralik, uzay yuku etkileri
- Kullanim: Yapisal analiz, arastirma amacli calismalar
Orbitrap
Iyonlar, merkezi bir elektrodun cevresinde orbital hareket yapar. Hareketin frekansindan m/z degeri hesaplanir.
- Avantaj: Cok yuksek cozunurluk (> 100.000 FWHM), yuksek kutle dogrulugu (< 1 ppm)
- Dezavantaj: Yuksek maliyet, yavas tarama hizi
- Kullanim: Proteomik, metabolomik, bilinmeyen bilesen tanimlama
Analizor Karsilastirma Tablosu
| Analizor | Cozunurluk | Kutle Dogrulugu | Hassasiyet | MS/MS | Hiz |
|---|---|---|---|---|---|
| Quadrupole | Dusuk | Orta | Yuksek | Hayir (tek basina) | Hizli |
| TOF | Yuksek | Yuksek | Orta | Hayir (tek basina) | Cok hizli |
| Ion Trap | Orta | Orta | Orta | Evet (MSn) | Orta |
| Orbitrap | Cok yuksek | Cok yuksek | Orta-yuksek | Evet | Yavas-orta |
LC-MS/MS: Tandem Kutle Spektrometresi
LC-MS/MS, iki kutle analizoru ardisik kullanarak hem secicilik hem hassasiyet acisindan buyuk avantaj saglar. En yaygin konfigurasyonu triple quadrupole (uc kutuplu, QqQ) sistemidir.
Calisma Prensibi
- Q1 (Birinci quadrupole): Hedef iyonu (precursor ion) secer
- q (Collision cell): Secilen iyon, inert gaz (argon, azot) ile carpistiriliarak parcalanir (fragmentasyon)
- Q2 (Ikinci quadrupole): Olusani fragment iyonlari secer
MRM (Multiple Reaction Monitoring) Modu
MRM, LC-MS/MS'in en guclu kantitatif analiz modudur. Belirli bir precursor ion -> product ion gecisi izlenir. Bu gecis, her bilesene ozgudur ve son derece yuksek secicilik saglar.
Ornek: Bir ilac molekulunun MRM gecisi
- Precursor ion: m/z 456 -> Product ion: m/z 312
Bu gecis, sadece o spesifik molekulun varliginda sinyal uretir. Matriks etkisi minimuma iner, sinyal/gurultu orani maksimuma cikar.
LC-MS/MS Uygulama Alanlari
- Cok dusuk konsantrasyonlarda kantitatif analiz (ppt seviyesi)
- Biyolojik sivilarda ilac ve metabolit olcumu (farmakokinetik)
- Gida kalinti analizleri (pestisit, veteriner ilac kalintilari)
- Klinik tani testleri (hormonlar, vitaminler, metabolik hastaliklar)
- Adli toksikoloji
Uygulama Alanlari
LC-MS'in kullanim alanlari son derece genistir. Iste belli basli sektorler ve tipik uygulamalar:
Farmasotik ve Ilac Gelistirme
- Ilac etkin madde tayini ve saflik analizi
- Farmakokinetik calismalar (kanda ilac konsantrasyonu izleme)
- Metabolit tanimlama ve profilleme
- Genotoksin analizleri (ppm alti seviyelerde)
- Stabilite calismalarinda bozunma urunu tanimlama
- Metod validasyonu calismalari
Gida Guvenligi
- Pestisit kalinti analizi (yuzlerce pestisit ayni anda)
- Mikotoksin (aflatoksin, okratoksin vb.) tayini
- Veteriner ilac kalintilari (antibiyotikler, hormonlar)
- Gida katki maddesi kontrolu
- Alerjne tayini
Cevre Analizi
- Su kalitesi izleme (farmasotik kalintilari, pestisitler)
- Toprak kontaminasyon analizi
- Endokrin bozucularin tespiti
- PFAS (per- ve polifloroalkil maddeler) analizi
Klinik ve Biyomedikal
- Yenidogan tarama testleri (metabolik hastaliklar)
- Vitamin D, tiroid hormonlari, steroid panelleri
- Terapotik ilac izleme (TDM)
- Biyobelirtec kesfine
Adli Bilimler
- Biyolojik materyallerde uyusturucu ve metabolit tespiti
- Zehirlenme vakalarinda toksikolojik tarama
- Doping kontrol analizleri
Metod Gelistirme Temel Ilkeleri
LC-MS metod gelistirme, sistematik bir yaklasim gerektirir. Temel adimlar:
1. Bilesen Ozelliklerinin Degerlendirilmesi
- Molekul agirligi, polarite (logP), pKa degerleri
- Cozunurluk profili
- Termal ve kimyasal stabilite
2. Iyonizasyon Optimizasyonu
- ESI mi APCI mi? (Bilesen polaritesine gore)
- Pozitif mi negatif mod mu? (Fonksiyonel gruplara gore)
- Kaynak parametreleri optimizasyonu (voltaj, gaz akislari, sicaklik)
3. Kromatografik Kosullarin Belirlenmesi
- Kolon secimi (C18, C8, HILIC, fenil vb.)
- Mobil faz kompozisyonu (su/asetonitril veya su/metanol)
- Gradient programi
- Akis hizi ve kolon sicakligi
- Enjeksiyon hacmi
4. MS Parametrelerinin Optimizasyonu
- MRM gecislerinin belirlenmesi (LC-MS/MS icin)
- Dwell time ayari
- Collision enerji optimizasyonu
5. Validasyon
Metod validasyonu, gelistirilen metodun amacina uygun oldugunu kanitlayan surecktir. Dogruluk, kesinlik, dogrusallik, LOD/LOQ, secicilik ve dayaniklilik parametreleri degerlendirilir.
Numune Hazirlama
LC-MS analizinde numune hazirlama, sonuclarin kalitesini dogrudan etkiler. Yetersiz numune hazirlama, matriks etkisi, kirlilik ve detektorde duyarlilik kaybi gibi sorunlara yol acar.
Yaygin Numune Hazirlama Teknikleri
Protein cokturme: Biyolojik numunelerde (kan, plazma) proteinlerin uzaklastirilmasi. Asetonitril veya metanol eklenerek proteinler cokturulur.
Sivi-sivi ekstraksiyon (LLE): Analitler, birbiriyle karismayan iki sivi faz arasinda dagitilir. Polar olmayan analitler icin etkilidir.
Kati faz ekstraksiyon (SPE): Numune, bir adsorban iceren kartus veya plakadan gecirilir. Analit tutulur, matriks bilesenleri yikanir, sonra analit eluet edilir. En yaygin numune hazirlama teknigidir.
Seyreltme ve enjeksiyon (dilute-and-shoot): En basit yaklasim. Numune seyreltilir ve dogrudan enjekte edilir. Hizlidir ama matriks etkisi yuksek olabilir.
Matriks Etkisi
LC-MS'e ozgu onemli bir sorun matriks etkisidir. Numunedeki diger bilesenler, hedef analitin iyonizasyonunu bastiabilir (iyon bastirma) veya artirabilir (iyon arttirma). Bu etki, kantitatif sonuclarin dogrulugunu bozar.
Matriks etkisini azaltmak icin:
- Etkili numune hazirlama (SPE ile temizleme)
- Izotop isaretli ic standart kullanimi
- Matriks eslestirmeli kalibrasyon
- Kromatografik ayirmanin iyilestirilmesi
Sikca Sorulan Sorular
LC-MS ile HPLC arasindaki fark nedir?
HPLC, sivi kromatografisi teknigidir ve genellikle UV, floresan veya RI detektoru ile kullanilir. LC-MS ise HPLC sistemine kutle spektrometresi detektoru baglanmis halidir. Yani LC-MS, HPLC'nin ayirma gucune kutle spektrometresinin tanimlama yetenegini ekler. HPLC yalnizca bilinen bilesenleri olcerken, LC-MS bilinmeyen bilesenleri de tanimlayabilir.
LC-MS/MS neden LC-MS'ten daha hassastir?
LC-MS/MS (tandem kutle), iki assamali kutle secimi yapar. Oncellikle hedef iyonu secer, sonra onu parcalar ve spesifik bir fragment iyonunu izler. Bu cift filtre, kimyasal gurultuyu dramatik olarak azaltir ve sinyal/gurultu oranini yukseltir. MRM modunda ppt (triliyonda bir) seviyesinde olcum yapilabilir.
ESI ve APCI arasinda nasil secim yapilir?
Genel kural: Bilesen polar veya iyonize olabilen fonksiyonel gruplara sahipse (amin, karboksilik asit, fenol gibi) ESI tercih edilir. Bilesen daha az polarsa ve termal olarak stabilse APCI daha iyi sonuc verir. Buyuk molekuller (peptidler, proteinler) icin her zaman ESI kullanilir.
LC-MS'te en sik karsilasilan sorun nedir?
Matriks etkisi, LC-MS'in en yaygin sorunudur. Numunedeki diger bilesenler hedef analitin iyonizasyonunu etkileyerek yanlis sonuclara yol acabilir. Bu sorunu asmanin en etkili yolu, izotop isaretli ic standart kullanmak ve etkili numune hazirlama uygulamaktir.
LC-MS egitimi almak icin kimya bilgisi gerekli mi?
Temel kimya ve analitik kimya bilgisi faydalidir ancak zorunlu degildir. Acadezone LC-MS egitim programlari, temel kavramlardan baslar ve kademeli olarak ileri konulara gecis yapar. Laboratuvar deneyimi olan katilimcilar icin ogrenme sureci daha hizli ilerler.
UHPLC-MS ile LC-MS arasindaki fark nedir?
UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography), klasik HPLC'ye gore daha kucuk partikul boyutu (< 2 mikrometre) ve daha yuksek basinc (1000 bar'a kadar) kullanan bir versiyonudur. UHPLC-MS, daha hizli analiz suresi, daha iyi cozunurluk ve daha yuksek hassasiyet saglar. Modern LC-MS sistemlerinin cogu UHPLC uyumludur.
